A液：1M，MnCl2；

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液：称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml 三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌121℃高压灭菌备用。

1. 取1管B液（0.6ml），全部加入C液（46ml）中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。

2. 划线得到单菌落，37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB培养基的三角瓶，37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时，将培养温度调至18℃剧烈振荡（280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

此法效率非常高，一般可到108，好时可到109，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。

1 、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。离心力要注意不要超过2500g，建议1500-2000g，5min 。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别是在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

2. 预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，在去残液时在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液。

3. 培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。

4. 培养基的pH值。这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值，还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH 值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。

5. 培养后的OD值。其实这并一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。

6. 培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。

7. 培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。

8. 此外文献报道，在保存感受态时，DMSO比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

9. 液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。